FOTOCOLORIMETRÍA Y CURVA DE CALIBRACIÓN

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FOTOCOLORIMETRÍA Y CURVA DE CALIBRACIÓN
MANUELA VASQUEZ MARTINEZ
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MANUELA VASQUEZ MARTINEZ
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  • La fotocolorimetría
  • método para hallar concentraciones de diferentes muestras y para seguir el curso de una reacción en experimentos de cinética química o enzimática.
  • Consiste en medir la intensidad de luz absorbida (A)  por una solución coloreada de uno o varios compuestos.
  • La absorción máxima ocurre a una longitud de onda, varía proporcionalmente con la concentración del compuesto en una solución.
  • Absorción de energía por sustancias coloreadas
  • El espectro electromagnético abarca diferentes longitudes de onda, que van desde las ondas de radio hasta rayos gamma.
  • Se sabe que a menor longitud de onda , mayor frecuencia y por tanto mayor energía.
  • Dependiendo de la frecuencia (energía) de la región del espectro, se afecta a las moléculas de diferentes formas.
  • Una sustancia es coloreada porque absorbe y transmite radiación electromagnética.
  • El color que se observa es una combinación de las longitudes de onda no absorbidas, y por lo tanto, transmitidas por la sustancia.
  • Espectro de absorción
  • Para saber  la energía de las transiciones  en una molécula cuando se irradia con luz U.V. o visible, es necesario trazar una gráfica.
  • Donde se relacione la intensidad de energía que se va absorbiendo en la región del espectro que nos interesa
  • Se llama espectro de absorción, y se puede deducir la longitud de onda en la cual el compuesto absorbe con mayor intensidad la energía.
  •  El conocimiento de la precisión la energía  de la transición de máxima absorción facilita la detección de la sustancia.
  • Facilitar la detección de la sustancia permite determinar su concentración o para seguirle la huella en experimentos de tipo cinético.
  • Energía absorbida y concentración (ley de Beer)
  • La intensidad de la energía absorbida depende del número de moléculas que sufren la transición electrónica a la onda  seleccionada.
  • calcula la concentración de una muestra problema, midiendo la absorbancia de la muestra patrón (Apat.) y de la muestra problema (Aprob.). 
  • Depende a su vez de la concentración de la especie y de la longitud de la celda que la contiene:
  •  Tanto a las soluciones patrón como a las muestras problema se les mide la absorbancia; con los datos de las soluciones patrón se construye la curva de calibración (A vs. C).
  • Las absorbancias de las muestras problema por interpolación de la curva, permiten calcular las concentraciones.
  • Cuantificación de proteínas
  • Se puede dar por los patrones de absorción de las radiaciones electromagnéticas de los grupos aromáticos.
  • También se puede dar por la reactividad del enlace peptídico, su contenido de nitrógeno, entre otras.
  • En la reacción de Biuret las sustancias que contengan dos o más enlaces peptídicos, interaccionan con sales de cobre en soluciones alcalinas, formando un complejo púrpura-violeta.
  • Espectrofotómetros
  • permiten determinar la absorbancia de la luz en numerosas sustancias orgánicas.
  • equipos  diseñados para medir directamente la intensidad de luz que es absorbida y/o transmitida por un compuesto en una solución.
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