Laboratorio Micro

Compuestos de los medios y usos:   -Peptonas: proteínas semidigeridas, principal fuente de Nitrógeno (aá). -Extracto de carne: (carne degradada) fuente de carbono inorgánico, nitrógeno, vitaminas y sales inorgánicas. -NaCl: fuente de sodio, ajuste de la osmolaridad del medio. -Agar: agente espesante, bastante resistente a la hidrólisis bacteriana (produce geles transparentes y resistentes a baja concentración :1’5%) se disuelve por ebullición y solidifica <45 grados centígrados.  -Sales inorgánicas : MgSO4: fuente de Mg2+y azufre NH4H2PO4: fuente de N y P (tampón) K2HPO4: fuente de P y K ( tampón)  -Glucosa: fuente de C orgánico y energía -Extracto de levadura: rico en vitamina B, Nitrógeno y Carbono (fuente de proteínas y ácidos nucleicos)  -D-manitol: inhibidor del crecimiento Gram –, fuente de C -Rojo fenol: indicador de pH (fermentación) -> diferencia organismos capaces de fermentar el manitol, produciendo un subproducto ácido. Disminuye el pH y el medio vira a amarillo.  Amarillo <6’8 Naranja >6’8. <8 Violeta >8 -Sales biliares: inhibe el crecimiento de Gram+ y algunos Gram- -Fucsina ácida: tóxica para Gram+  -Azul de bromotimol : indicador de pH Amarillo-> ácido Verde-> neutro Azul-> básico -Citrato férrico-amónico: fuente de carbohidrato, que mantiene el pH. Al ser consumido, el medio se alcaliniza -> colonias azules.  -Triptona: digerido pancreático de la caseína, fuente de N -KCl: fuente de K+y Cl -Almidón soluble: promueve el crecimiento eliminando factores tóxicos del medio de cultivo, además es fuente de nutrientes.  -Rojo neutro: indicador de pH. Las bacterias coliformes (Gram-) son fermentadoras de lactosa, crecen y reducen el pH virando el medio a un color rojo/rosa intenso. Rojo (salmon oscuro) = neutro Fucsia= ácido (Lac+)   -Cristal violeta: selectivo para Gram-, inhibie el crecimiento de Gram+.   Medios.   -TSA: medio complejo, de amplia gama ( no selectivo ni diferencial), para organismos heterótrofos -Caldo inorgánico sintético/sales (CIS): medio definido para organismos autótrofos foto y quimiosintéticos -Caldo glucosa sales (CGS): medio definido para organismos heterótrofos   -Agar manitol sal: (diseñado para Staphylococcus aureus) medio selectivo, ya que posee una concentración de sal (NaCl) 8 veces mayor que la habitual que inhibe el crecimiento de Gram – y favorece el de Gram+ ( solo halófilos o halotolerantes -> todos los cocos Gram+ toleran en mayor o menor medida las sales). Medio diferencial, debido a la presencia del rojo fenol, detecta organismos capaces de fermentar el manitol (alcohol-> ácido), virando el pH y por tanto el color del medio de rojo a amarillo.   -Agar entérico Hektoen (entérico= intestinal): ( diseñado para Salmonella) medio selectivo, por la presencia de las sales biliares en elevada concentración-> para contrarrestar el efecto tóxico contiene también en elevada concentración proteosa-peptona. La lactosa, la sacarosa y la salicina tienen una función diferencial para colonias fermentadoras que producen ácido coloreándolas ( Salmonellano es capaz de utilizar ninguna). Además, el NaS2O3y el citrato férrico-amónico detectan la producción de H2S de Salmonella, dando lugar a colonias con un punto negro central por la precipitación de sulfuros metálicos. La fucsina ácida y el azul de bromotimol son indicadores de pH, de forma que a pH neutro el medio es de color verde, si el pH es ácido su color es amarillo, y de color azul a un pH básico.   *E.colidegrada los azúcares  cambiando el indicador de pH. Salmonellano degrada el azúcar, alcaliniza por el citrato + sulfuro.   -Caldo rojo de metilo-Voges-Proskauer (MR-VP): detecta la fermentación de glucosa por la vía butanodiólica. Es un medio complejo, general y no diferencial. Se utiliza para la prueba del mismo nombre.    -Agar MacConkey: medio complejo, selectivo para Gram- de hábitat intestinal por su contenido en sales biliares y por le cristal violeta, tóxico para Gram+. Diferencial por su contenido en Lactosa, y por la presencia del indicador de pH Rojo neutro, que detectan la producción de ácidos por la fermentación virando a un color fucsia, si las colonias son lactosa +. (E.colise puede detectar ya que precipita las sales biliares enturbiando el medio o por la bajada de pH)    -Medio Hugh y Leifson; (prueba O/F) medio semisólido que tiene peptona como fuente de N, un carbohidrato como fuente de C y energía (generalmente glucosa, ya que es el más sencillo y por tanto el más habitual, todos los organismos capaces de utilizar algún otro carbohidrato podrán hacerlo también con la glucosa), y azul de bromotimol como indicador de pH ( medio diferencial) .             -> Tipos de medio de cultivo:   Definidos: sustancias químicamente puras->Protótrofos (sin requerimientos                nutricionales)         Complejos: hidrolizados y extractos -> Protótrofos y autótorfos. (los     organismos protótrofos también pueden crecer en medios complejos, crecen mejor)         Líquidos: no sirven para aislar microorganismos, auqnue estos crecen más rápido . 0% de agar Sólidos: para la obtención de colonias aisladas (en placa Petri o en tubo de ensayo, donde se conservan mejor ya que se mantiene la humedad) 1’5% agar Semisolido: Se dispone en tubos, para siembra en profundidad (anaerobios facultativos) y para observar la motilidad del microorganismo. AL estar más hidratado se mantienen mejor el cultivo. 1% de agar.      Generales: para microorganismos sin requerimientos especiales Enriquecidos: con elementos nutritivos especiales   Diferenciales: con componentes que cambian de aspecto detectando una actividad concreta-> distinción de microorganismos. Selectivos: inhiben el crecimiento de ciertos microorganismos no deseados. (muy usados en microbiología clínica)    -> Métodos de esterilización , para asegurar las condiciones asépticas   Calor: -Seco: mediante el flambeo del material con el quemador de gas o impregnado en alcohol, o con los hornos Pasteur que se utilizan para materiales termoresistentes, debidamente envueltos de forma que también resistan al calor, durante largos periodos de aplicación (160º, 2 horas o 180º, 1’5 horas) -Húmedo: Autoclaves, donde se genera una atmosfera de vapor de agua a presiones controladas, lo que disminuye la temperatura necesaria para la esterilización . (121º,15-20 minutos o 112º,30 minutos) . Sirve para todo tipo de materiales, medio de cultivo..o,Tydalización, aplicar ebulliciones consecutivas separadas por periodos de temperatura normal de 1 día (para eliminar células vegetativas )    Filtración: Exclusivamente para líquidos, pasándolos por una membrana porosa capaz de retener las células microbianas (no virus).  Radiaciones:  (UV) que causan daños irreparables en los ácidos nucleicos de células y virus, aunque es poco penetrante y solo es efectiva en superficies (placas Petri) -> cabinas de flujo laminar Agentes químicos: Desinfectantes domésticos, alcoholes… (poco usados)        PRÁCTICA 1 Tipos de inoculación e instrumentos: -De líquido a líquido, con asa redonda para cantidades mínimas, o con pipetas para cantidades mayores. -De líquido a sólido, a tubo de agar inclinado con asa redonda , o a placa por triple estría con asa redonda o siembra en superficie con pipeta y asa Digranski.  -De sólido a líquido con asa redonda -De sólido a sólido , a tubo de agar inclinado con asa redonda, a tubo de medio semisólido por picadura con asa recta, o a placa por estría con asa redonda.    PRÁCTICA 2 Agar malta favorece el crecimiento de hongos sobre las bacterias. TSA favorece el crecimiento de bacterias.    PRÁCTICA 3   Las colonias presentan pigmentación colonial, si las propias bacterias presentan pigmentos asociados a las membrana celular ( no son pigmentos fotosintéticos, son debidos a la adaptación a ambientes con radiación solar -> fotoprotectores) , o presentan pigmentación difusible, el pigmento se excreta y tiñe el medio.  Otras tienen propiedades agarolíticas, que tienen la capacidad de degradar el agar , por lo que estará más profunda dentro del agar. ( adaptación a vivir en ambientes marinos degradando el agar agar  y algunos hongos) .   -> Muestra-> Aislamiento primario-> Cultivo puro-> cultivo de conservación (para trabajar en el laboratorio) . A partir del cultivo de conservación se pueden obtener glicerinado ( medio acuoso 10% glicerol + congelación -80º) o liófilo (medio acuoso+ liofilización -> congelación súbita -80º + sublimación del hielo a elevada presión y desecar la muestra sin calentarla)    PRÁCTICA 4 Para poder observar correctamente el crecimiento microbiano en los tubos de ensayo, es importante no inocular una gran cantidad  inicialmente, ya que si se inocula cantidad, el tubo ya estará turbio y no se apreciará el crecimiento correctamente, dando un falso positivo.    PRÁCTICA 6   Hongos->pluricelulares, sin tejidos diferenciados, filamentosos. Observación microscópica: la tinción que se utiliza es el lactofenol-azul de algodón (agente dispersante y de contraste para la observación de las preparaciones de hongos. )       PRÁCTICA 7 Para una buena observación de la célula microbiana es necesario aumentar el contraste entre ésta y el fondo.  Se consigue mediante técnicas de tinción o mediante la microscopia de contraste de fases, que permite observarlas sin teñirlas. Para ver la motilidad es importante usar un cultivo joven, que estará metabólicamente más activo, por lo que se podrá apreciar mejor. Además, no se recomienda cargar mucho la preparación porque el exceso impedirá observarla adecuadamente.      -> Tipos de movimiento:   -Movimiento browniano, es una agitación leve debido a la agitación térmica de las partículas, no es un movimiento activo, por lo que no debe considerarse como movilidad -Movimiento debido a la corriente del agua entre el porta y el cubre, se da en conjunto y tampoco se considera movilidad.  -Desplazamientos en línea recta, debidos a la actividad flagelar -Giros rápidos de una célula sobre si misma,  las células flageladas pueden quedar pegadas al porta mediante el flagelo, causando este tipo de movimientos, que son por tanto indicador de que la célula posee al menos un flagelo.   -Movilidad por deslizamiento, es más lenta y por tanto más difícil de ver.  -Twitching: la célula sufre pequeñas sacudidas en contacto con un sustrato solido, debido a la acción de las fimbrias polares.   PRÁCTICA 8   Las tinciones se aplican generalmente después de un proceso de fijación por calor, que mata las células y las adhiere al porta, impidiendo que sean arrastradas en las aplicaciones de los colorantes.  Los colorantes más habituales son básicos y se unen a estructuras con carga negativa, como las superficies bacterianas. -> tipos de tinciones -Simples:   un único colorante con la función de contrastar células y fondo, tienen cargas + y se unen iónicamente. Pueden ser positivas, si se fija a las células coloreándolas en contraste con el medio blanco, o negativas, si no penetra en las células y solo oscurece el medio que las rodea dejando las células blancas.  -Diferenciales: con dos colorantes diferentes, distingue tipos celulares o diferentes estructuras celulares en función de su respuesta diferencial al proceso. Las diferenciales entre células distinguen Gram+ y Gram- … y las de estructuras permiten detectar estructuras a nivel subcelular. Incluyen tres fases: Colorante primario  Decoloración diferencial (alcohol 96º) Colorante de contraste, que teñirá solo las células decoloradas.  (Ambos colorantes son capaces de teñir todas las células, ya que tienen componentes aniónicos)   Tinción de Gram:   El cristal violeta se adhiere mucho más  al peptidoglicano de Gram+. El alcohol actúa como disolvente orgánico en la membrana externa de Gram- , mientras que deshidrata el peptidoglicano de Gram+ , cerrándolo mas. La fucsina básica tiñe también ambos tipos celulares, ya que forma enlaces iónicos igualmente, pero el Gram+ al mantener el colorante cristal violeta que es mucho más oscuro no es aprecia en la observación. Es importante que el cultivo de células sea joven, ya que el peptidoglicano puede estar degradado o bien ser más estrecho, por lo que podría decolorarse igualmente con el alcohol.  El lugol es una gente que favorece la cristalización del colorante sobre las estructuras celulares, formando un complejo establemente unido, lo que favorece que se mantenga después de la decoloración .  Tinciones de endosporas bacterianas Las endoesporas con se unen con colorantes iónicos (en las tinciones anteriores aparecen zonas no teñidas dentro de las células esporulantes. Se utiliza el verde de malaquita con emisión de vapores (en caliente) para teñirlas. Favorece la tinción que el cultivo sea viejo o que esté creciendo en condiciones limitantes.  La fucsina básica es el colorante de contraste.  Durante el enfoque del microscopio, las esporas se quedan en planos diferentes a las células, ya que conservan su volumen, mientras que las células al fijarse lo pierden.  *Colorantes usados: verde de malaquita (esporas), cristal violeta (tinción de Gram), azul de metileno, fucsina básica, nigrosina (tinción negativa)   PRÁCTICA 9 Recuentos indirectos (imprecisos), se evalúa la cantidad de microorganismos mediante la medida de concentración o abundancia de un componente, o la turbidez .  Limitaciones como cultivos heterogéneos, o diferentes estados fisiológicos, en los que se encuentran en cantidades distintas.   Recuentos directos (se deberá repetir el experimento para sacar el número medio y la estadística.  -totales: se cuentan aquellas células que conservan su integridad celular pero pueden o no ser capaces de crecer, sin usar medio de cultivo. Mediante microscopia con un portaobjetos con diseños que ayudan a contarlas de la forma más precisa posible o mediante contadores automatizados Coulter, que cuentan de forma individualizada los microorganismos de una muestra (centelleo). -Viables: capaces de desarrollarse en un medio de cultivo. La limitación es poder diseñar un medio y condiciones de cultivo que permitan el crecimiento de cualquier microorganismo presente de forma simultanea. Por lo que es importante dar el resultado de estos recuentos especificando las condiciones.  Para poder realizar el recuento, se debe obtener un número determinado de colonias crecidas en la placa (30-300 sobre membrana o 20-200 si es siembra en superficie, según procedimiento). Para ello, la muestra puede concentrarse, mediante filtración, o bien hacer diluciones decimales seriadas de esta. * el recuento de viables en medio líquido no cuenta directamente los microorganismos, si no que es un cálculo estadístico.  Recuento de microorganismos totales en placa Independientemente de si son viables o no . Se cuentan levaduras ya que tienen un mayor tamaño. Si fueran células móviles se fijan con formol.  Permite conocer y estandarizar el volumen de muestra en el que se hace el recuento, permitiendo así su réplica exacta tantas veces como sea necesario.  Con el objetivo 10x se ve toda la cuadricula, para situarse en una de las esquinas. Para hacer el recuento se utiliza 40x.  Se contarán 20 diagonales y 20 las otras 20. Se establecen dos de los cuatro lados en los que no se contabilizaran las células encima de la línea.  Vtotal= 1*0,1= 1/10 mm3(400 cuadraditos)  1 cuadradito = 1/400 mm3= 4*106mL  R= x* 4*106cel/ mL x-> media de células contadas en total / 400 cuadraditos Recuento de viables en placa por extensión  Condicionado por las características del medio y del microorganismo. Se cuentan unidades formadoras de colonias en medio sólido.  UFC/gr= x*1/dilución recuento*1/volumen sembrado*1/dilución homogenado x->Número medio de colonias. Recuento de calvas en placa ( bacteriófagos) Se cuentan la cantidad de viriones con capacidad infectiva en una solución de bacteriófagos sobre un huésped adecuado, que estará en condiciones óptimas, ya que en estado de senescencia no son infectados. Se hacen diluciones decimales seriadas para encontrar la concentración de calvas necesaria para el recuento.  Se siembra un césped de la cepa bacteriana especifica del fago y después la suspensión del fago en las diferentes diluciones.  * unidad formadora de calva = virion  El medio donde se realiza el cultivo es Top-agar fundido, en el que se transfieren la solución con los fagos y la bacteria huésped, y una placa de L-agar solidificado, donde se verterá el contenido del tubo anterior. Recuento de viables por filtración en membrana   PRÁCTICA 10   Enzimas hidrolíticas extracelulares (exoenzimas) . Se requieren medios especiales enriquecidos con la molécula de la hidrólisis a estudiar. Se siembran haciendo una línea recta porque al sembrar 4 microorganismos en la misma placa, se intenta evitar que su crecimiento se solape juntándose los halos de hidrólisis.  -Actividad amilasa: en agar-almidón, y se añade después de incubadas el reactivo lugol. Se observará un color violeta en las zonas donde se mantenga el almidón, y halos transparentes alrededor de las bacterias hidrolíticas del almidón. -Actividad  caseinasa : La presencia de la caseína en el agar caseína le da una opacidad que desaparece cuando el microorganismo hidroliza la caseína. Se observa de forma inmediata, sin reactivos.  -Actividad lipasa: En agar-Tween80 (lípido sintético) que contiene además sales de calcio, lo que causa la precipitación de Ca+2 formando pequeños cristales cuando se hidroliza el lípido, formando así alrededor un halo opaco.  -Actividad DNAsa: En agar-DNAsa, añadiendo HCl , después de unos minutos se podrá observar como el DNA del medio ha precipitado haciéndolo opaco, salvo en las zonas donde los microorganismos lo hayan hidrolizado, donde se formará un halo transparente.  *se puede valorar semicuantitativamente la producción de las exoenzimas midiendo el halo de hidrólisis. Cuanto mayor sea el diámetro, más enzimas habrá excretado.     Metabolismo de carbohidratos en presencia o ausencia de O2(O/F) Detecta si la bacteria es capaz de utilizar la glucosa oxidándola o fermentándola. ( el azúcar del medio se puede cambiar para estudiar si hacen uso de él o no) Los cambios de pH y por tanto del color del medio permitirán deducir los procesos llevados a cabo por el microorganismo.  Azul-> utiliza la fuente de proteínas (peptona)  Verde-> no se ha producido ninguna acción  Amarillo-> consume la glucosa del medio La bacteria se siembra por picadura, y uno de los dos tubos se sella con vaselina para que las condiciones de crecimiento sean anaerobias.  +La acidificación de ambos tubos(en todo el tubo) indica indica un proceso de fermentación de la glucosa. (Si el tubo de fermentación es amarillo, el otro también debería serlo) -> Proceso fermentativo +La acidificación exclusivamente en superficie del tubo aerobio indica que la glucosa solo se metaboliza en presencia de O2. -> Proceso oxidativo +La alcalinización en la superficie del tubo aerobio indica que la bacteria no utiliza el carbohidrato, si no que utiliza la peptona del medio como fuente de energía y al hidrolizarla, los grupos animo suben el pH.      *Podrán crecer: Aerobios estrictos, que crecerán únicamente en la parte superficial del tubo sin vaselina y pueden utilizar la glucosa o la peptona, o crecerán anaerobios facultativos que usarán la glucosa en ambos tubos.    O/F-> anaerobios facultativos O/- y A/- : aerobios estrictos       Metabolismo fermentativo de carbohidratos: ruta fermentativas en enterobacterias , prueba MR-VP Esta prueba se realiza a microorganismos Gram- ,anaerobios facultativos, O/F positivos. Dentro de la familia enterobacteria, existen dos rutas fermentativas que distingue entre géneros.  Tras haber incubado las bacterias problema en un medio liquido glucosado, se estudian los productos finales de la fermentación para saber qué ruta ha operado, añadiendo reactivos.  La fermentación ácido-mixta se comprueba añadiendo Rojo Metilo ,que se volverá de color rojo intenso a pH bajo (RM+) o se mantendrá en un tono anaranjado a pH superior a 4,2 (RM-) La fermentación butanodiolica se detecta con KOH (40%) y alfa-naftol (5% p/v en etanol) oxidándose el producto y dando lugar a un color cereza (VP+)  *los reactivos ponen de manifiesto los productos de los dos tipos de fermentación.  *Las reacciones son excluyentes.  *Las cepas no fermentadoras serán negativas en ambas pruebas.    Catalasa y citocromo-oxidasa -Citocromo-oxidasa: Forma parte de la cte y su presencia se detecta mediante un reactivo que cambia de color al oxidarse específicamente por este citocromo.  Se cortan unas tiras de papel y se impregnan en el reactivo, al extender el cultivo por encima se colorea o no. *El reactivo hay que usarlo inmediatamente después d haber sido preparado, ya que el propio oxígeno del aire también produce esta reacción. Incluso las asas de hierro.    -Catalasa: descompone el H2O2en agua y oxígeno, y está presente en muchos de las bacterias que crecen en presencia de O2. Simplemente se añade H2O2 a un porta y se suspende un cultivo en la gota. Si se produce un burbujeo, es catalasa positivo.   Determinación de Gram por lisis con KOH(3%) Los Gram- se lisan con el KOH liberando el DNA que es muy viscos y forma hilos. Lo que no ocurre en Gram+. A un porta se le añade una gota de KOH y se suspende un cultivo en la gota, dando ligeras vueltas con el asa para emulsionarlo y separándolo para comprobar si se ha formado el hilo de DNA.    PRÁCTICA 11   Se siembra una placa de agar Mueller-Hinton con la bacteria problema y discos de papel impregnados en dosis conocidas de los antimicrobianos. Estos discos contienen una inicial y un numero que indican el nombre y su concentración. El agente antimicrobiano difunde en el agar, por lo que si se solapan los halos de inhibición no se podrá determinar su sensibilidad.  La aparición del halo no indica que el microorganismo sea sensible, hay que estudiar el diámetro frente a la concentración para ver si es efectivo o no frente a la bacteria, o si habría que aplicar una dosis demasiado elevada… ya que cada agente antimicrobiano difunde de forma distinta.  *CMI-> concentración mínima inhibitoria, a la que la bacteria deja de poder crecer. Se determina en medios líquidos con concentraciones crecientes del agente antimicrobiano.  *Dianas de los antibióticos: La síntesis de la pared celular, síntesis de proteínas (atacan ribosomas bacterianos), producen poros en la membrana celular, inactivan girasas bacterianas… Pueden tener un efecto bacteriolítico o bacteriostático ( dificulta el crecimiento sin lisar las células) .    PRÁCTICA 12   Pruebas fisiológicas en sistemas miniaturizados para la identificación, en pocillos que contienen cantidades mínimas de los medios de cultivo necesarios deshidratados para la caracterización de unas características concretas. *Dependiendo de las características iniciales hay pruebas de las tiras que convienen o no, o se necesitan otro tipo de pruebas adicionales.  La tira API 20E, está diseñada para enterobacterias, por lo que es conveniente que los microorganismos problema sean sacarolíticos ( O/F +). -ONPG-> detecta la presencia de la beta-galactosidasa, que rompe la lactosa en sus dos componentes. ( amarillo +, incoloro-) -ADH, LDC, ODC-> actividad descarboxilasa, transforma los aá en sus componentes básicos, produciendo aminas que acidifican el medio virando el rojo fenol (indicador de pH) de amarillo a rojo, debido a la fermentación en anaerobiosis ( con vaselina) . (rojo+, amarillo-)  -CIT-> utilización del citrato como fuente de energía y C. En medio Hektoen, con indicador de pH azul de bromotimol ( azul en la cúpula +, verde-)  -H2S-> producción de compuestos de azufre a partir del tiosulfato. El sulfuro de hierro hace que el pocillo se vuelva negro si la reacción se ha producido (negro+, incoloro-) -URE-> enzima ureasa, hidrólisis del grupo amino. (rosa+, incoloro-) -TDA-> enzima que desamina el triptófano produciendo un precipitado marrón. -IND-> si se produce este compuesto, reacciona con el reactivo Kovacs (cereza+, incoloro-) -VP-> con los reactivos KOH y alfa-naftol (rojo/rosa+, incoloro -)  -GEL-> la gelatina tiene unida a su estructura grafito, por lo que si el organismo la hidroliza, el grafito se libera (negro+, aglomerado negro-) -GLU,MAN,INO,SOR,RHA,SAC,MEL,AMY, ARA-> son compuestos azucarados o alcoholes, y se estudia la producción de ácido a partir de ellos ( no tiene porqué ser mediante fermentación). CO el indicador de pH azul de bromotimil, (amarillo+, azul- utiliza las peptonas, verde es negativo dudoso*) * es muy importante controlar el tiempo de incubación porque los ácidos producidos pueden ser reutilizados por la bacteria revirtiendo la acidificación, por lo que daría un falso negativo.